Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
6. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результат испытания является достоверным лишь при условии получения однозначно положительных результатов для положительного контроля (контролей) и однозначно отрицательных результатов для отрицательного контроля (контролей). В связи с исключительно высокой чувствительностью метода ПЦР и с риском попадания загрязняющих примесей, положительные результаты должны подтверждаться двукратным полным повторением проце-
дуры испытания, по возможности, с новой аликвотой образца. Считают, что образец дает положительную реакцию, если не менее одного из повторных испытаний дает положительный результат.
7. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА
7.1 Валидация системы для количественного определения методом
ПЦР.
Программа валидации должна включать валидацию оборудования и используемого метода ПЦР. Следует учитывать положения, изложенные в руководстве ICH (тема Q2B) «Валидация аналитического метода: методология».
Для валидации ПЦР-испытания обязательным является применение официальных рабочих стандартных образцов или стандартных препаратов внутреннего применения, калиброванных относительно Международных Стандартов, для последовательностей-мишеней, для определения которых система будет использоваться.
При валидации должно быть определено положительное граничное значение. Положительное граничное значение определяется как минимальное количество последовательностей-мишеней в объеме образца, которые могут быть определены в 95% испытаний. Положительное граничное значение зависит от таких взаимосвязанных факторов, как объем экстрагированного образца и эффективность методологии экстракции, транскрипция РНК-мишени в cDNA, процесс амплификации и детекции.
При определении предела детекции системы следует учитывать положительные граничные значения для каждой последовательности-мишени и результаты проведения испытания выше и ниже этих значений.
7.2. Контроль качества реагентов.
Все реагенты, имеющие критическое значение для используемой методологии, должны проходить контроль перед использованием в рутинных испытаниях. Их пригодность или непригодность основывается на заранее определенных критериях качества.
Праймеры являются важнейшими компонентами ПЦР-анализа, и поэтому следует уделять особое внимание их строению, чистоте и валидации для ПЦР-анализов. Каждая новая партия праймеров перед введением в испытание должна быть испытана на специфичность, эффективность амплификации и отсутствие ингибирующих примесей. Праймеры могут быть подвергнуты модификации (например, связыванием с флуорофором или антигеном) для проведения детекции ам-пликона специфическими методами при условии, что такие модификации не приведут к ингибированию правильного и эффективного протекания процесса амплификации последовательности-мишени.
7.3. Контроль хода испытания.
7.3.1. Внешние контроли.
Для минимизации риска загрязнения и обеспечения адекватной чувствительности в состав каждого ПЦР-испытания вводят следующие внешние контроли:
- положительный контроль: в нем содержится определенное количество копий последовательности-мишени; количество копий определяется индивидуально для каждой системы и кратно положительному граничному значению данной системы;
- отрицательный контроль: образец аналогичного основного состава, для которого доказано отсутствие последовательностей-мишеней.
7.3.2. Внутренний контроль.
Внутренние контроли представляют собой определенные последовательности нуклеиновых кислот, содержащие сайты связывания с праймерами. Внутренние контроли должны амплифицироваться так же эффективно, как и испытуемая последовательность-мишень, но ампликоны должны иметь четкие отличия. Тип нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК), используемой в качестве внутреннего контроля, должен быть тем же, что и в испытуемом материале. Внутренний контроль предпочтительно добавлять к испытуемому материалу до выделения нуклеиновой кислоты; при этом он может использоваться для общего контроля процесса (экстракция, обратная транскрипция, амплификация, детекция).
7.4. Внешняя оценка качества
Участие во внешних программах оценки качества представляет собой важную процедуру обеспечения качества ПЦР-анализов для каждой лаборатории и каждого оператора.
Следующий раздел приводится для информации.
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (МАНК) В ОПРЕДЕЛЕНИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С (HCV) В ПУЛАХ ПЛАЗМЫ: РУКОВОДСТВО
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Большинство аналитических методик, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, представляют собой качественные испытания на наличие нуклеиновых кислот. Существует также некоторое количество методик количественного определения (либо внутренних, либо коммерчески доступных). Для определения загрязнения пулов плазмы РНК HCV адекватными являются качественные тесты, которые могут быть рекомендованы как предельные испытания при контроле содержания примесей, в соответствии с указаниями в Техническом руководстве по разработке монографий «Pharmeuropa», декабрь 1999, глава III «Валидация аналитических методик». В этом руководстве описаны лишь методы валидации качественных аналитических методик оценки загрязнения пулов плазмы РНК HCV на основе амплификации нуклеиновых кислот. Поэтому двумя наиболее важными характеристиками для валидации аналитического метода являются его специфичность и предел детекции. Кроме того, должна быть оценена устойчивость аналитического метода.
